Técnicas de siembra en agar para seguimiento del crecimiento vegetal

Uno de los aspectos metodológicos clave de nuestro proyecto «Germinación y crecimiento de plantas en microgravedad simulada» era desarrollar una técnica sencilla y asequible económicamente que nos permitiera realizar un seguimiento controlado de las primeras etapas de crecimiento de las plantas objeto de nuestro estudio (soja, Glycine max, y lenteja, Lens culinaris), comenzando por su germinación.

Necesitábamos algún tipo de contenedor simple, con, al menos, alguna cara transparente para visualizar el proceso de crecimiento cuando fuese necesario. Decidimos que también debía ser bastante aplanado para limitar los ejes en los que se observarían los cambios y así poder realizar mediciones más precisas. Comentamos el problema con varios porfesores y el profesor de Tecnología nos dio la idea de emplear viejos estuches de CD. El dispositivo resultó ser una opción muy buena: resistente, ligero, transparente y… muy barato! Tenía además las dimensiones adecuadas para estudiar el crecimiento de nuestras plantas en un sistema de referencia próximo a las dos dimensiones, lo cual facilitaría mucho las medidas de nuestras observaciones.

El segundo problema que debíamos solucionar era encontrar un medio de siembra que pudiera ser contenido en los estuches, que proporcionara agua a las semillas de forma permanente y que permitiera fijar la posición de la semilla pero que no las ocultara para poder seguir su crecimiento. Elegimos la opción de usar el agar-agar.

Alga del género Gelidium de la que se extrae el agar-agar. Fuente: http://www.plantascurativas.com

El agar es una sustancia de aspecto parecido a la gelatina corriente, pero que en realidad es un polisacárido que se extrae de algas pertenecientes al género Gelidium. Como la gelatina, se puede disolver en agua a partir de 80ºC, pero al enfriarse se solidifica formando un gel con un alto contenido de agua. El agar es muy empleado en microbiología para cultivar bacterias en placas de Petri, pero nosotros íbamos a cultivar semillas.

Lo primero que hicimos fue poner a punto la técnica. Inicialmente aprendimos a sellar los laterales de los estuches de CD con plástico adhesivo para poder verter el agar aún fundido y  formar una fina lámina de agar. El mecanismo era sencillo, pero a la vez complicado. El agua caliente hacía que si el sellado no era perfecto, todo el agar se escapara rápidamente por cualquier rendija.

Durante la puesta a punto de la técnica, descubrimos es que era importante dejar una fina capa de aire entre la lámina de agar y una de las paredes de los estuches. Si no lo hacíamos las semillas se comportaban exactamente de la misma forma que si estuvieran sumergidas en agua: no germinaban. Por el contrario, permitiendo el contacto de toda la superficie de agar  con el aire, las semillas sí germinaban. Suponemos que el problema era la disponibilidad de oxígeno para las plantas.

Las siguientes pruebas las dedicamos a seleccionar la concentración de agar más adecuada. Si la concentración del medio de agar era demasiado baja, el peso de la propia lámina de agar al ser colocadao el estuche verticalmente hacía que la preparación se derrumbara. Por el contrario, si la concetración era demasiado elevada, el crecimiento de la raíz se veía dificultado y la deshidratación ocurría rápidamente. Después de probar diversas concentraciones, observamos que la más adecuada era de un 1% (m/v).

Puedes ver algunos pasos de la técnica en el siguiente video, en el que también te mostramos el funcionamiento de los dispositivos que vamos a usar para simular microgravedad.

Para facilitar realizar las siembras siempre de la misma forma preparamos unas plantillas de siembra  realizadas con LibreCad. Las usábamos para orientarnos en el momento de colocar las semillas en la lámina de agar. Este era otro momento un poco delicado. Debíamos colocar las semillas cuando el agar estaba aún fundido pero lo suficientemente frío como para no afectar a las semillas. Nuestro coordinador nos ayudaba a decidir ese momento. También procurábamos situar las semillas con una misma orientación para comparar más fácilmente los resultados.

Elaboración de la plantilla de siembra con LibreCAD

Otro problema que debimos afrontar fue el crecimiento de  hongos sobre la lámina de agar. Estos tardaban varios días en hacerse visibles, pero en ocasiones crecían lo suficiente como para afectar a una parte de la preparación. Para minimizar el problema adoptamos varias estrategias. En primer lugar, los estuches eran cuidadosamente desinfectados con aguay lejía o con alcohol antes de la siembra. Observamos que los hongos aparecían dispersos en la lámina y no asociados a las semillas, por lo que dedujimos que estos no estaban en las semillas sino que accedían a la preparación desde el exterior.

También probamos a añadir una pequeña cantidad de sulfato de cobre (que se usa habitualmente como antifúngico) al medio. Nos encontramos con la dificultad de que, aunque las plantas adultas toleran más o menos bien esta sustancia, las pequeñas plántulas en crecimiento de nuestros estuches eran especialmente sensibles al sulfato de cobre. Tras probar varias concentraciones concluimos que una concentración del 0,01% mejoraba la resitencia del medio al crecimiento de hongos sin afectar significativamente a la germinación de las semillas.

Después de poner a punto la técnica durante varias semanas nos dispusimos a desarrollar algunas observaciones preliminares con semillas de soja. Para ellos también tuvimos que aprender algunas técnicas para realizar análisis de imagen sobre las que te ofrecemos información en la siguiente entrada.